កត្តាជ្រៀតជ្រែកក្នុងប្រតិកម្ម PCR

ក្នុងអំឡុងពេលប្រតិកម្ម PCR កត្តាជ្រៀតជ្រែកមួយចំនួនត្រូវបានជួបប្រទះជាញឹកញាប់។
ដោយសារតែភាពប្រែប្រួលខ្ពស់នៃ PCR ការចម្លងរោគត្រូវបានចាត់ទុកថាជាកត្តាសំខាន់បំផុតមួយដែលប៉ះពាល់ដល់លទ្ធផល PCR ហើយអាចបង្កើតលទ្ធផលវិជ្ជមានមិនពិត។
ការរិះគន់ស្មើៗគ្នាគឺជាប្រភពផ្សេងៗគ្នាដែលនាំឱ្យមានលទ្ធផលមិនពិត-អវិជ្ជមាន។ ប្រសិនបើផ្នែកសំខាន់មួយ ឬច្រើននៃល្បាយ PCR ឬប្រតិកម្ម amplification ខ្លួនវាត្រូវបានរារាំង ឬរំខាន ការវិភាគរោគវិនិច្ឆ័យអាចត្រូវបានរារាំង។ នេះអាចនាំឱ្យមានការថយចុះប្រសិទ្ធភាព និងសូម្បីតែលទ្ធផលអវិជ្ជមានមិនពិត។
បន្ថែមពីលើការរារាំង ការបាត់បង់ភាពសុចរិតនៃអាស៊ីត nucleic គោលដៅអាចកើតឡើងដោយសារលក្ខខណ្ឌនៃការដឹកជញ្ជូន និង/ឬការផ្ទុកមុនពេលរៀបចំគំរូ។ ជាពិសេស សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ ឬការផ្ទុកមិនគ្រប់គ្រាន់អាចនាំឱ្យខូចកោសិកា និងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក។ ការ​ជួសជុល​កោសិកា និង​ជាលិកា និង​ការ​បង្កប់​ប៉ារ៉ាហ្វីន​គឺ​ជា​មូលហេតុ​ដែល​គេ​ស្គាល់​យ៉ាង​ច្បាស់​នៃ​ការ​បែក​ខ្ញែក DNA និង​ជា​បញ្ហា​ជាប់​រហូត (មើល​រូប​ទី 1 និង 2)។ នៅក្នុងករណីទាំងនេះ សូម្បីតែភាពឯកោ និងការបន្សុតដ៏ប្រសើរបំផុតក៏នឹងមិនអាចជួយបានដែរ។

រូបភាពទី 1 | ឥទ្ធិពលនៃ immobilization លើសុចរិតភាព DNA
Agarose gel electrophoresis បានបង្ហាញថាគុណភាពនៃ DNA ដែលដាច់ចេញពីផ្នែកប៉ារ៉ាហ្វីននៃការធ្វើកោសល្យវិច័យមានភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងខ្លាំង។ DNA នៃប្រវែងបំណែកមធ្យមផ្សេងគ្នាមានវត្តមាននៅក្នុងការស្រង់ចេញ អាស្រ័យលើវិធីសាស្ត្រជួសជុល។ DNA ត្រូវ​បាន​រក្សា​ទុក​តែ​នៅ​ពេល​ដែល​បាន​ជួសជុល​ក្នុង​សំណាក​ក្លាស្សេ​ដើម និង​ក្នុង​ទម្រង់​អព្យាក្រឹត​ដែល​មាន​ផ្ទុក​សារធាតុ Formalin។ ការប្រើប្រាស់ថ្នាំ Bouin ដែលមានជាតិអាស៊ីតខ្លាំង ឬសារធាតុ Formalin ដែលមានផ្ទុកអាស៊ីតខ្លាំង បណ្តាលឱ្យបាត់បង់ DNA យ៉ាងខ្លាំង។ ប្រភាគដែលនៅសល់ត្រូវបានបំបែកយ៉ាងខ្លាំង។
នៅខាងឆ្វេង ប្រវែងនៃបំណែកត្រូវបានបង្ហាញជា kilobase pair (kbp)

រូបភាពទី 2 | ការបាត់បង់ភាពសុចរិតនៃគោលដៅអាស៊ីត nucleic
(ក) គម្លាត 3′-5′ នៅលើខ្សែទាំងពីរនឹងបណ្តាលឱ្យមានការបំបែកនៅក្នុង DNA គោលដៅ។ ការសំយោគ DNA នឹងនៅតែកើតឡើងនៅលើបំណែកតូចៗ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ប្រសិនបើកន្លែង annealing primer បាត់នៅលើបំណែក DNA នោះមានតែ linear amplification ប៉ុណ្ណោះដែលកើតឡើង។ ក្នុង​ករណី​អំណោយផល​បំផុត បំណែក​អាច​ត្រឡប់​ទៅវិញ​ទៅមក ប៉ុន្តែ​ទិន្នផល​នឹង​មាន​ទំហំ​តូច ហើយ​នៅ​ក្រោម​កម្រិត​រាវរក។
(ខ) ការបាត់បង់មូលដ្ឋាន ជាចម្បងដោយសារតែការ depurination និងការបង្កើត thymidine dimer នាំឱ្យមានការថយចុះនៃចំនួន H-bonds និងការថយចុះនៃ Tm ។ ក្នុងកំឡុងដំណាក់កាលកំដៅពន្លូត សារធាតុ primers នឹងរលាយឆ្ងាយពី DNA ម៉ាទ្រីស ហើយនឹងមិនរលាយសូម្បីតែនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌតឹងរ៉ឹងតិចក៏ដោយ។
(គ) មូលដ្ឋាន thymine ដែលនៅជាប់គ្នាបង្កើតបានជា TT dimer ។
បញ្ហាទូទៅមួយទៀតដែលជារឿយៗកើតឡើងនៅក្នុងការវិនិច្ឆ័យម៉ូលេគុលគឺការបញ្ចេញអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកគោលដៅតិចជាងមុន បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការទាញយក phenol-chloroform ។ ក្នុងករណីធ្ងន់ធ្ងរ នេះអាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងអវិជ្ជមានមិនពិត។ ពេលវេលាជាច្រើនអាចត្រូវបានរក្សាទុកដោយការឆ្អិន lysis ឬការរំលាយអង់ស៊ីមនៃកំទេចកំទីកោសិកា ប៉ុន្តែវិធីសាស្ត្រនេះច្រើនតែបណ្តាលឱ្យមានប្រតិកម្ម PCR ទាប ដោយសារការបញ្ចេញអាស៊ីត nucleic មិនគ្រប់គ្រាន់។

ការទប់ស្កាត់សកម្មភាពប៉ូលីមែរក្នុងអំឡុងពេលពង្រីក

ជាទូទៅ ការរារាំងត្រូវបានប្រើជាគំនិតកុងតឺន័រ ដើម្បីពិពណ៌នាអំពីកត្តាទាំងអស់ដែលនាំទៅដល់លទ្ធផល PCR ល្អបំផុត។ ក្នុងន័យជីវគីមីយ៉ាងតឹងរឹង ការទប់ស្កាត់ត្រូវបានកំណត់ចំពោះសកម្មភាពរបស់អង់ស៊ីម ពោលគឺវាកាត់បន្ថយ ឬទប់ស្កាត់ការបំប្លែងផលិតផលស្រទាប់ខាងក្រោម តាមរយៈអន្តរកម្មជាមួយទីតាំងសកម្មនៃ DNA polymerase ឬ cofactor របស់វា (ឧទាហរណ៍ Mg2+ សម្រាប់ Taq DNA polymerase)។
សមាសធាតុនៅក្នុងគំរូ ឬសតិបណ្ដោះអាសន្នផ្សេងៗ និងសារធាតុចម្រាញ់ដែលមានផ្ទុកសារធាតុ reagents អាចរារាំងដោយផ្ទាល់នូវអង់ស៊ីម ឬអន្ទាក់ cofactors របស់វា (ឧទាហរណ៍ EDTA) ដោយហេតុនេះធ្វើឱ្យសារធាតុ polymerase អសកម្ម ហើយនាំឱ្យលទ្ធផល PCR អវិជ្ជមានថយចុះ ឬក្លែងក្លាយ។
ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ អន្តរកម្មជាច្រើនរវាងសមាសធាតុប្រតិកម្ម និងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដែលមានគោលដៅក៏ត្រូវបានគេកំណត់ថាជា 'PCR inhibitors' ផងដែរ។ នៅពេលដែលភាពសុចរិតនៃកោសិកាត្រូវបានរំខានដោយឯកោ ហើយអាស៊ីត nucleic ត្រូវបានបញ្ចេញ អន្តរកម្មរវាងគំរូ និងដំណោះស្រាយជុំវិញរបស់វា និងដំណាក់កាលរឹងអាចកើតឡើង។ ឧទាហរណ៍ 'អ្នករើសអេតចាយ' អាចចង DNA តែមួយ ឬពីរខ្សែ តាមរយៈអន្តរកម្មដែលមិនមែនជាកូវ៉ាលេន និងរំខានដល់ភាពឯកោ និងការបន្សុតដោយកាត់បន្ថយចំនួនគោលដៅដែលនៅទីបំផុតទៅដល់នាវាប្រតិកម្ម PCR ។
ជាទូទៅ PCR inhibitors មានវត្តមាននៅក្នុងសារធាតុរាវរាងកាយភាគច្រើន និងសារធាតុ reagents ដែលប្រើសម្រាប់ការធ្វើតេស្តរោគវិនិច្ឆ័យ (អ៊ុយក្នុងទឹកនោម អេម៉ូក្លូប៊ីន និង heparin ក្នុងឈាម) អាហារបំប៉ន (សមាសធាតុសរីរាង្គ glycogen ខ្លាញ់ Ca2+ ions) និងសមាសធាតុនៅក្នុងបរិស្ថាន (phenols)។ លោហធាតុធ្ងន់)

ថ្នាំទប់ស្កាត់ PCR ដែលរីករាលដាលកាន់តែច្រើនអាចត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងបាក់តេរី និងកោសិកា eukaryotic, DNA ដែលមិនមែនជាគោលដៅ, DNA-binding macromolecules នៃ matrices ជាលិកា និងឧបករណ៍មន្ទីរពិសោធន៍ដូចជាស្រោមដៃ និងប្លាស្ទិក។ ការបន្សុតអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកកំឡុងពេល ឬក្រោយពេលស្រង់ចេញ គឺជាវិធីសាស្ត្រដែលពេញចិត្តក្នុងការដក PCR inhibitors ។
សព្វថ្ងៃនេះ ឧបករណ៍ទាញយកដោយស្វ័យប្រវត្តិជាច្រើនអាចជំនួសពិធីការដោយដៃជាច្រើន ប៉ុន្តែការស្ដារឡើងវិញ 100% និង/ឬការបន្សុតគោលដៅមិនដែលត្រូវបានសម្រេចឡើយ។ ថ្នាំទប់ស្កាត់សក្តានុពលអាចនៅតែមាននៅក្នុងអាស៊ីត nucleic បន្សុត ឬអាចមានប្រសិទ្ធភាពរួចហើយ។ មានយុទ្ធសាស្រ្តផ្សេងៗគ្នាដើម្បីកាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់នៃថ្នាំ inhibitors ។ ការជ្រើសរើសវត្ថុធាតុ polymerase ដែលសមស្របអាចមានឥទ្ធិពលយ៉ាងសំខាន់ទៅលើសកម្មភាព inhibitor ។ វិធីសាស្រ្តដែលបានបញ្ជាក់ផ្សេងទៀតដើម្បីកាត់បន្ថយការទប់ស្កាត់ PCR គឺការបង្កើនកំហាប់សារធាតុ polymerase ឬការប្រើប្រាស់សារធាតុបន្ថែមដូចជា BSA ។
ការទប់ស្កាត់ប្រតិកម្ម PCR អាចត្រូវបានបង្ហាញដោយការប្រើប្រាស់ការគ្រប់គ្រងគុណភាពដំណើរការផ្ទៃក្នុង (IPC) ។
ត្រូវតែយកចិត្តទុកដាក់ដើម្បីយកសារធាតុ reagents និងដំណោះស្រាយផ្សេងទៀតនៅក្នុងឧបករណ៍ស្រង់ចេញ ដូចជា អេតាណុល, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol និង phenol ចេញពីអាស៊ីត nucleic ដាច់ដោយឡែកដោយជំហានលាងសម្អាតយ៉ាងហ្មត់ចត់។ អាស្រ័យលើការផ្តោតអារម្មណ៍របស់ពួកគេ ពួកគេអាចធ្វើឱ្យសកម្ម ឬរារាំង PCR ។