កត្តាជ្រៀតជ្រែកក្នុងប្រតិកម្ម PCR

ក្នុងអំឡុងពេលប្រតិកម្ម PCR កត្តាជ្រៀតជ្រែកមួយចំនួនត្រូវបានជួបប្រទះជាញឹកញាប់។
ដោយសារតែភាពរសើបខ្ពស់នៃ PCR ការចម្លងរោគត្រូវបានចាត់ទុកថាជាកត្តាសំខាន់បំផុតមួយដែលប៉ះពាល់ដល់លទ្ធផល PCR ហើយអាចបង្កើតលទ្ធផលវិជ្ជមានមិនពិត។
ប្រភពផ្សេងៗដែលនាំឱ្យមានលទ្ធផលអវិជ្ជមានមិនពិតក៏មានសារៈសំខាន់ដូចគ្នាដែរ។ ប្រសិនបើផ្នែកសំខាន់ៗមួយ ឬច្រើននៃល្បាយ PCR ឬប្រតិកម្មពង្រីកខ្លួនវាត្រូវបានរារាំង ឬជ្រៀតជ្រែក ការវិភាគរោគវិនិច្ឆ័យអាចត្រូវបានរារាំង។ នេះអាចនាំឱ្យមានប្រសិទ្ធភាពថយចុះ និងសូម្បីតែលទ្ធផលអវិជ្ជមានមិនពិត។
បន្ថែមពីលើការរារាំង ការបាត់បង់ភាពសុចរិតនៃអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកគោលដៅអាចកើតឡើងដោយសារតែលក្ខខណ្ឌដឹកជញ្ជូន និង/ឬផ្ទុកមុនពេលរៀបចំគំរូ។ ជាពិសេស សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ ឬការផ្ទុកមិនគ្រប់គ្រាន់អាចនាំឱ្យខូចខាតដល់កោសិកា និងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក។ ការជួសជុលកោសិកា និងជាលិកា និងការបង្កប់ប៉ារ៉ាហ្វីន គឺជាមូលហេតុដែលគេស្គាល់យ៉ាងច្បាស់នៃការបំបែក DNA និងជាបញ្ហារ៉ាំរ៉ៃ (សូមមើលរូបភាពទី 1 និងទី 2)។ ក្នុងករណីទាំងនេះ សូម្បីតែការញែក និងការបន្សុទ្ធដ៏ល្អប្រសើរក៏មិនអាចជួយបានដែរ។

រូបភាពទី 1 | ឥទ្ធិពលនៃការធ្វើឱ្យអសកម្មលើភាពសុចរិតនៃ DNA
អេឡិចត្រូផូរេស៊ីសជែល អាហ្គារ៉ូស បានបង្ហាញថា គុណភាពនៃ DNA ដែលញែកចេញពីផ្នែកប៉ារ៉ាហ្វីននៃការធ្វើកោសល្យវិច័យមានភាពខុសប្លែកគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់។ DNA ដែលមានប្រវែងបំណែកជាមធ្យមខុសៗគ្នាមានវត្តមាននៅក្នុងសារធាតុចម្រាញ់អាស្រ័យលើវិធីសាស្ត្រជួសជុល។ DNA ត្រូវបានរក្សាទុកលុះត្រាតែជួសជុលនៅក្នុងគំរូកកដើម និងនៅក្នុងហ្វ័រម៉ាលីនអព្យាក្រឹតដែលមានសារធាតុ buffered។ ការប្រើប្រាស់សារធាតុជួសជុល Bouin ដែលមានជាតិអាស៊ីតខ្លាំង ឬហ្វ័រម៉ាលីនដែលមានអាស៊ីតហ្វ័រមិកដែលមិនមានសារធាតុ buffered បានបណ្តាលឱ្យបាត់បង់ DNA យ៉ាងសំខាន់។ ប្រភាគដែលនៅសល់ត្រូវបានបំបែកយ៉ាងខ្លាំង។
នៅខាងឆ្វេង ប្រវែងនៃបំណែកត្រូវបានបង្ហាញជាគូគីឡូបៃ (kbp)

រូបភាពទី 2 | ការបាត់បង់ភាពសុចរិតនៃគោលដៅអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក
(ក) គម្លាត 3′-5′ លើខ្សែទាំងពីរនឹងបណ្តាលឱ្យមានការបាក់នៅក្នុង DNA គោលដៅ។ ការសំយោគ DNA នឹងនៅតែកើតឡើងនៅលើបំណែកតូច។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ប្រសិនបើកន្លែងធ្វើឱ្យ primer annealing បាត់នៅលើបំណែក DNA មានតែការពង្រីកលីនេអ៊ែរប៉ុណ្ណោះដែលកើតឡើង។ ក្នុងករណីអំណោយផលបំផុត បំណែកអាចធ្វើឱ្យឆ្អែតឡើងវិញ ប៉ុន្តែទិន្នផលនឹងតូច និងទាបជាងកម្រិតរកឃើញ។
(ខ) ការបាត់បង់បាស ដែលភាគច្រើនដោយសារតែការដកភាពបរិសុទ្ធ និងការបង្កើតឌីមឺរ thymidine នាំឱ្យមានការថយចុះនៃចំនួនចំណង H និងការថយចុះនៃ Tm។ ក្នុងដំណាក់កាលឡើងកំដៅដែលអូសបន្លាយ ប្រាយម័រនឹងរលាយចេញពី DNA ម៉ាទ្រីស ហើយនឹងមិនឆេះសូម្បីតែក្រោមលក្ខខណ្ឌដែលមិនសូវតឹងរ៉ឹងក៏ដោយ។
(គ) បាស​ធីមីន​ដែល​នៅ​ជាប់​គ្នា​បង្កើត​បាន​ជា​ឌីមឺរ TT ។
បញ្ហាទូទៅមួយទៀតដែលតែងតែកើតឡើងនៅក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យម៉ូលេគុលគឺការបញ្ចេញអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកគោលដៅដែលមិនសូវល្អប្រសើរបើប្រៀបធៀបទៅនឹងការស្រង់ចេញ phenol-chloroform។ ក្នុងករណីធ្ងន់ធ្ងរ នេះអាចជាប់ទាក់ទងនឹងលទ្ធផលអវិជ្ជមានមិនពិត។ ពេលវេលាច្រើនអាចត្រូវបានសន្សំសំចៃដោយការបំបែកកោសិកាដោយរំពុះ ឬការរំលាយកំទេចកំទីកោសិកាដោយអង់ស៊ីម ប៉ុន្តែវិធីសាស្ត្រនេះជារឿយៗបណ្តាលឱ្យមានភាពរសើប PCR ទាបដោយសារតែការបញ្ចេញអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកមិនគ្រប់គ្រាន់។

ការរារាំងសកម្មភាពប៉ូលីមែររ៉ាសកំឡុងពេលពង្រីក

ជាទូទៅ ការរារាំងត្រូវបានប្រើជាគោលគំនិតកុងតឺន័រដើម្បីពិពណ៌នាអំពីកត្តាទាំងអស់ដែលនាំឱ្យមានលទ្ធផល PCR មិនល្អប្រសើរ។ ក្នុងន័យជីវគីមីយ៉ាងតឹងរ៉ឹង ការរារាំងត្រូវបានកំណត់ចំពោះសកម្មភាពរបស់អង់ស៊ីម ពោលគឺវាកាត់បន្ថយ ឬការពារការបំលែងស្រទាប់ខាងក្រោម-ផលិតផលតាមរយៈអន្តរកម្មជាមួយកន្លែងសកម្មនៃ DNA polymerase ឬសហកត្តារបស់វា (ឧទាហរណ៍ Mg2+ សម្រាប់ Taq DNA polymerase)។
សមាសធាតុនៅក្នុងគំរូ ឬសារធាតុសតិបណ្ដោះអាសន្ន និងសារធាតុចម្រាញ់ផ្សេងៗដែលមានផ្ទុកសារធាតុប្រតិកម្មអាចរារាំងអង់ស៊ីមដោយផ្ទាល់ ឬចាប់សហកត្តារបស់វា (ឧទាហរណ៍ EDTA) ដោយហេតុនេះធ្វើឱ្យប៉ូលីមែររ៉ាសអសកម្ម ហើយជាលទ្ធផលនាំឱ្យលទ្ធផល PCR អវិជ្ជមាន ឬថយចុះ។
ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ អន្តរកម្មជាច្រើនរវាងសមាសធាតុប្រតិកម្ម និងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដែលមានគោលដៅក៏ត្រូវបានកំណត់ថាជា 'សារធាតុទប់ស្កាត់ PCR' ផងដែរ។ នៅពេលដែលភាពសុចរិតនៃកោសិកាត្រូវបានរំខានដោយការញែកចេញ ហើយអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកត្រូវបានបញ្ចេញ អន្តរកម្មរវាងគំរូ និងដំណោះស្រាយជុំវិញរបស់វា និងដំណាក់កាលរឹងអាចកើតឡើង។ ឧទាហរណ៍ 'សារធាតុរើសអេតចាយ' អាចភ្ជាប់ DNA ខ្សែតែមួយ ឬខ្សែពីរតាមរយៈអន្តរកម្មមិនមែនកូវ៉ាឡង់ និងជ្រៀតជ្រែកជាមួយនឹងការញែកចេញ និងការបន្សុទ្ធដោយកាត់បន្ថយចំនួនគោលដៅដែលនៅទីបំផុតទៅដល់ធុងប្រតិកម្ម PCR។
ជាទូទៅ សារធាតុទប់ស្កាត់ PCR មានវត្តមាននៅក្នុងសារធាតុរាវក្នុងរាងកាយ និងសារធាតុប្រតិកម្មភាគច្រើនដែលប្រើសម្រាប់ការធ្វើតេស្តរោគវិនិច្ឆ័យគ្លីនិក (អ៊ុយរ៉េក្នុងទឹកនោម អេម៉ូក្លូប៊ីន និងហេប៉ារីនក្នុងឈាម) អាហារបំប៉ន (សមាសធាតុសរីរាង្គ គ្លីកូហ្សែន ខ្លាញ់ អ៊ីយ៉ុង Ca2+) និងសមាសធាតុនៅក្នុងបរិស្ថាន (ហ្វេណុល លោហធាតុធ្ងន់)។

ថ្នាំទប់ស្កាត់ PCR ដែលមានលក្ខណៈរីករាលដាលជាងនេះអាចរកឃើញនៅក្នុងបាក់តេរី និងកោសិកា eukaryotic DNA មិនមែនគោលដៅ ម៉ាក្រូម៉ូលេគុលចង DNA នៃម៉ាទ្រីសជាលិកា និងឧបករណ៍មន្ទីរពិសោធន៍ដូចជាស្រោមដៃ និងផ្លាស្ទិច។ ការបន្សុទ្ធអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកក្នុងអំឡុងពេល ឬក្រោយពេលស្រង់ចេញគឺជាវិធីសាស្ត្រដែលពេញចិត្តសម្រាប់ការដកថ្នាំទប់ស្កាត់ PCR ចេញ។
សព្វថ្ងៃនេះ ឧបករណ៍ទាញយកដោយស្វ័យប្រវត្តិជាច្រើនអាចជំនួសពិធីការដោយដៃជាច្រើន ប៉ុន្តែការស្តារឡើងវិញ និង/ឬការបន្សុទ្ធគោលដៅ 100% មិនដែលត្រូវបានសម្រេចបានឡើយ។ ថ្នាំទប់ស្កាត់ដែលអាចមានសក្តានុពលអាចនៅតែមាននៅក្នុងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដែលបានបន្សុទ្ធ ឬអាចមានប្រសិទ្ធភាពរួចហើយ។ មានយុទ្ធសាស្ត្រផ្សេងៗគ្នាដើម្បីកាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់នៃថ្នាំទប់ស្កាត់។ ជម្រើសនៃប៉ូលីមែររ៉ាសដែលសមស្របអាចមានផលប៉ះពាល់យ៉ាងសំខាន់ទៅលើសកម្មភាពថ្នាំទប់ស្កាត់។ វិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀតដែលបានបង្ហាញឱ្យឃើញដើម្បីកាត់បន្ថយការរារាំង PCR គឺការបង្កើនកំហាប់ប៉ូលីមែររ៉ាស ឬការប្រើប្រាស់សារធាតុបន្ថែមដូចជា BSA។
ការរារាំងប្រតិកម្ម PCR អាចត្រូវបានបង្ហាញដោយការប្រើប្រាស់ការគ្រប់គ្រងគុណភាពដំណើរការផ្ទៃក្នុង (IPC)។
ត្រូវប្រុងប្រយ័ត្នក្នុងការយកសារធាតុប្រតិកម្ម និងដំណោះស្រាយផ្សេងទៀតទាំងអស់នៅក្នុងឧបករណ៍ស្រង់ចេញ ដូចជាអេតាណុល EDTA CETAB LiCl GuSCN SDS អ៊ីសូប្រូផាណុល និងហ្វេណុល ចេញពីអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដាច់ដោយឡែកដោយជំហានលាងសម្អាតយ៉ាងហ្មត់ចត់។ អាស្រ័យលើកំហាប់របស់វា ពួកវាអាចធ្វើឱ្យសកម្ម ឬរារាំង PCR។