កត្តាជ្រៀតជ្រែកក្នុងប្រតិកម្ម PCR

ក្នុងកំឡុងពេលប្រតិកម្ម PCR បានយ៉ាងខ្លាំងកត្តាជ្រៀតជ្រែកមួយចំនួនត្រូវបានជួបប្រទះ។
ដោយសារតែភាពប្រែប្រួលខ្ពស់នៃ PCR, ការចម្លងរោគត្រូវបានគេចាត់ទុកថាជាកត្តាសំខាន់បំផុតមួយដែលជះឥទ្ធិពលដល់លទ្ធផល PCR ហើយអាចបង្កើតលទ្ធផលវិជ្ជមានមិនពិត។
សំខាន់ស្មើគ្នាគឺជាប្រភពផ្សេងៗដែលនាំឱ្យមានលទ្ធផលមិនពិត - អវិជ្ជមាន។ ប្រសិនបើផ្នែកសំខាន់មួយឬច្រើននៃល្បាយ PCR ឬប្រតិកម្មអពិកុកវាត្រូវបានរារាំងឬជ្រៀតជ្រាបឬជ្រៀតជ្រែកជាមួយការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យអាចត្រូវបានរារាំង។ នេះអាចនាំឱ្យកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាពនិងសូម្បីតែលទ្ធផលអវិជ្ជមានមិនពិត។
បន្ថែមពីលើការទប់ស្កាត់ការខាតបង់នៃភាពត្រឹមត្រូវនៃការធ្វើឱ្យមានជាតិអាស៊ីតអាស៊ីតអាចកើតឡើងដោយសារតែការដឹកជញ្ជូននិង / ឬលក្ខខណ្ឌផ្ទុកមុនពេលការរៀបចំគំរូ។ ជាពិសេសសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ឬការផ្ទុកមិនគ្រប់គ្រាន់អាចបណ្តាលឱ្យខូចខាតនៃកោសិកានិងអាស៊ីតស្នូល។ ការជួសជុលការជួសជុលកោសិកានិងជាលិកាហើយការបង្កប់ប្រេងប៉ារ៉ាហ្វីនគឺជាមូលហេតុដែលគេស្គាល់យ៉ាងច្បាស់នៃការបែកបាក់ឌីអិនអេនិងបញ្ហាជាប់លាប់ (សូមមើលរូបទី 1 និងទី 2) ។ ក្នុងករណីទាំងនេះសូម្បីតែភាពឯកោនិងភាពឯកោល្អបំផុតនិងការបន្សុតនឹងមិនជួយទេ។

រូបភាពទី 1 | ឥទ្ធិពលនៃការមិនអាចធ្វើចលនាបានលើភាពស្មោះត្រង់ឌីអិនអេ
agarose gel chelephoresis បានបង្ហាញថាគុណភាពនៃឌីអិនអេដែលដាច់ឆ្ងាយពីផ្នែកប្រេងប៉ារ៉ាហ្វីននៃយានយន្តដែលមានភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់។ ឌីអិនអេនៃប្រវែងបំណែកមធ្យមធម្មតាមានវត្តមាននៅក្នុងការដកស្រង់អាស្រ័យលើវិធីសាស្ត្រនៃការជួសជុល។ ឌីអិនអេត្រូវបានរក្សាទុកតែនៅពេលដែលបានជួសជុលសំណាកទឹកកកដែលមានដើមកំណើតនិងមានលក្ខណៈអព្យាក្រឹតភាពដែលមានអព្យាក្រឹត។ ការប្រើប្រាស់មើមដែលមានជាតិអាសុីតដែលមានជាតិអាសុីតដែលមានរាងដូចអាស៊ីតដែលមានជាតិអាស៊ីតបានបណ្តាលឱ្យមានការបាត់បង់ឌីអិនអេយ៉ាងសំខាន់។ ប្រភាគដែលនៅសល់គឺត្រូវបានបែកបាក់ខ្លាំង។
នៅខាងឆ្វេងប្រវែងនៃបំណែកត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងគូលីបបលគូ (KBP)

រូបភាពទី 2 | ការបាត់បង់ភាពសុចរិតនៃគោលដៅអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ែរ
(ក) គម្លាត 3'5 'គម្លាតទាំងលើ strands ទាំងពីរនឹងនាំឱ្យមានការសម្រាកនៅក្នុងឌីអិនអេគោលដៅ។ សំយោគឌីអិនអេនៅតែនឹងកើតមានលើបំណែកតូច។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយប្រសិនបើគេហទំព័រ Annealing Primeer Mere បានបាត់ខ្លួននៅលើបំណែក DNA មានតែលីនេអ៊ែរពង្រីកលីនេអ៊ែរកើតឡើងទេ។ ក្នុងករណីដែលអំណោយផលបំផុតបំណែកអាចធ្វើឱ្យឡើងវិញនូវគ្នាទៅវិញទៅមកប៉ុន្តែទិន្នផលនឹងមានកំរិតរាវនិងទាបជាងការរាវរក។
(ខ) ការបាត់បង់មូលដ្ឋានភាគច្រើនដោយសារតែការធ្វើឱ្យមានភាពច្របូកច្របល់និងការបង្កើតមមឌីដិនអង្រឹងនាំឱ្យមានការថយចុះចំនួនមូលបត្របំណុល H និងការធ្លាក់ចុះនៃ T ។ ក្នុងដំណាក់កាលកម្សាន្តពន្លូតពន្លូតអ្នកបឋមនឹងរលាយចេញពីម៉ាទ្រីសម៉ាទ្រីសហើយនឹងមិនចូលរួមក្នុងកម្មវិធីណាក៏ដោយក្រោមលក្ខខណ្ឌតឹងរឹង។
(គ) មូលដ្ឋានរបស់ Thymine ដែលនៅជាប់នឹងមានភាពស្រអាប់។
បញ្ហាទូទៅមួយទៀតដែលជារឿយៗកើតឡើងក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យម៉ូលេគុលគឺជាការដោះលែងតិចជាងប្រសើរជាងល្អបំផុតនៃអាស៊ីតស្នូលគោលដៅបើប្រៀបធៀបនឹងការស្រាវជ្រាវ Phenol-Chloroform ។ ក្នុងករណីធ្ងន់ធ្ងរនេះអាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការអវិជ្ជមានមិនពិត។ ពេលវេលាច្រើនអាចត្រូវបានរក្សាទុកដោយឡៃស្យូសពុះឬការរំលាយអាហារនៃកំទេចកំទីកោសិកាប៉ុន្តែវិធីសាស្ត្រនេះច្រើនតែបណ្តាលឱ្យមានភាពប្រែប្រួលទាបដោយសារតែការចេញផ្សាយដោយអាស៊ីដនុយក្លេអ៊ែរមិនគ្រប់គ្រាន់ក៏ដោយ។

ការហាមឃាត់សកម្មភាពវត្ថុធាតុ polymerase ក្នុងកំឡុងពេលពង្រីក

ជាទូទៅការទប់ស្កាត់ត្រូវបានប្រើជាគំនិតកុងតឺន័រដើម្បីពិពណ៌នាអំពីកត្តាទាំងអស់ដែលនាំឱ្យមានលទ្ធផលផ្ទុកជាមុន។ ក្នុងន័យជីវភាពជីវគីមីយ៉ាងតឹងរឹងការទប់ស្កាត់ត្រូវបានកំណត់ចំពោះសកម្មភាពរបស់អង់ស៊ីមពោលគឺវាជួយកាត់បន្ថយឬការពារការបម្លែងស្រទាប់ខាងក្រោមតាមរយៈការផ្លាស់ប្តូរជាមួយនឹងវឌ្ឍនភាពរបស់ Polymerase dna ឬ mg2 + សម្រាប់ polymerase taq dna) ។
សមាសធាតុនៅក្នុងគំរូឬសតិបណ្ដោះអាសន្ននិងការដកស្រង់ផ្សេងៗអាចរារាំងដោយផ្ទាល់ឬអង់តែនរបស់វា (ឧ។ អេធីធី) ដោយហេតុនេះដោយហេតុនេះដោយហេតុនេះធ្វើឱ្យការថយចុះឬលទ្ធផលនៃ PCR អវិជ្ជមានមិនពិត។
ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយអន្តរកម្មជាច្រើនរវាងសមាសភាគប្រតិកម្មនិងអាស៊ីតស្នូលដែលមានផ្ទុកសារធាតុត្រូវបានកំណត់ជា 'pcr inhibitors' ។ នៅពេលដែលភាពត្រឹមត្រូវនៃកោសិកាត្រូវបានរំខានដោយភាពឯកោនិងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ែរត្រូវបានចេញផ្សាយអន្តរកម្មរវាងគំរូនិងដំណោះស្រាយជុំវិញរបស់វានិងដំណាក់កាលរឹងដែលអាចកើតមាន។ ឧទាហរណ៍ 'អ្នករើសសំរាម' អាចចងខ្សែតែមួយ - ឬឌីអិនអេដែលជាប់គ្នាពីរដងតាមរយៈអន្តរកម្មដែលមិនមែនជាការសម្ងាត់ហើយជ្រៀតជ្រែកជាមួយភាពឯកោនិងការបន្សុតដោយកាត់បន្ថយចំនួនគោលដៅដែលនៅទីបំផុតឈានដល់នាវាប្រតិកម្ម PCR ។
ជាទូទៅជំងឺរលាកស្រោមជ្រូកមានវត្តមាននៅក្នុងវត្ថុរាវរាងកាយភាគច្រើនដែលត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យរោគសញ្ញា (អ៊ុយហ្គីនក្នុងឈាម) អាហារបំប៉នជាតិខ្លាញ់ក្នុងបរិស្ថាន (Phenols ក្នុងបរិស្ថាន)

សារធាតុចិញ្ចឹមដែលមានប្រជាប្រិយភាពទូទៅអាចត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងបាក់តេរីនិងកោសិកា Eukaryotic ដែលមិនមែនជា DNA ដែលមិនមានគោលដៅម៉ាក្រូម៉ូលីខននៃម៉ាធ្រូជាលិកានិងឧបករណ៍មន្ទីរពិសោធន៍ដូចជាស្រោមដៃនិងប្លាស្ទិក។ ការបន្សុទ្ធអាស៊ីដនុយនុយក្នុងកំឡុងពេលឬក្រោយពេលស្រង់ចេញគឺជាវិធីសាស្ត្រដែលពេញចិត្តសម្រាប់ការដកចេញ PCR ជំនួយ។
សព្វថ្ងៃនេះឧបករណ៍ទាញយកស្វ័យប្រវត្តិកម្មជាច្រើនអាចជំនួសពិធីសារដោយដៃជាច្រើនប៉ុន្តែការជាសះស្បើយ 100% និង / ឬការបន្សុទ្ធនៃគោលដៅមិនដែលត្រូវបានសម្រេចឡើយ។ ថ្នាំប្រឆាំងដែលមានសក្តានុពលនៅតែអាចមានវត្តមាននៅក្នុងអាស៊ីដស្នូលដែលបានបន្សុតឬប្រហែលជាមានប្រសិទ្ធិភាពរួចទៅហើយ។ មានយុទ្ធសាស្រ្តផ្សេងគ្នាមានដើម្បីកាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់នៃ inibititors ។ ជម្រើសនៃវត្ថុធាតុ polymerase សមស្របអាចជះឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងទៅលើសកម្មភាពរបស់ inibitor ។ វិធីសាស្រ្តដែលបង្ហាញឱ្យឃើញផ្សេងទៀតដើម្បីកាត់បន្ថយការទប់ស្កាត់ PCRC កំពុងបង្កើនការផ្តោតអារម្មណ៍របស់ Polymerase ឬការដាក់ពាក្យបន្ថែមដូចជា BSA ។
ការទប់ស្កាត់ប្រតិកម្ម PCR អាចត្រូវបានបង្ហាញដោយការប្រើប្រាស់ការត្រួតពិនិត្យគុណភាពនៃដំណើរការផ្ទៃក្នុង (IPC) ។
ការយកចិត្តទុកដាក់ត្រូវតែយកទៅយក reacents និងដំណោះស្រាយផ្សេងទៀតចេញដូចជាអេតាណុល EDTA, Cetab, Guscn, SDS, Isopropanol និង Phenol ពីអាស៊ីត cornureize មួយជំហាន។ អាស្រ័យលើការផ្តោតអារម្មណ៍របស់ពួកគេពួកគេអាចធ្វើឱ្យសកម្មឬរារាំង PCR ។